Скрининг СМА и первичных иммунодефицитов

Название набора реагентов

«Genome-X SMA/TREC/KREC testing kit. Набор реагентов для выявления гомо- и гетерозиготных делеций в гене SMN1, отвечающего за развитие спинальной мышечной атрофии, и внехромосомных кольцевых ДНК как биомаркеров первичных иммунодефицитов»

Целевой аналит

Делеция 7 экзона в гене SMN1 в гомо- и гетерозиготном состоянии
Внехромосомные кольцевые ДНК-молекулы TREC и KREC

Принцип метода исследования

Исследуемый материал: смывы сухих пятен крови с фильтр-карт.

Подготовка к исследованию: не требуется.

Функциональное назначение: неонатальный и селективный скрининг спинальной мышечной атрофии и первичных иммунодефицитных состояний.

Метод исследования: ПЦР-РВ.

Необходимый анализатор: Амплификатор для ПЦР-РВ, например, QuantStudio 5 (Applied Biosystems), ABI 7500 (Applied Biosystems), Light Cycler 96 (Roche), Rotor Gene (Corbett).

Принцип работы: В основе работы набора реагентов лежит быстрая элюция ДНК из сухих пятен крови и последующая постановка ПЦ-РВ. Элюция ДНК происходит из кружка сухого пятна крови, полученного с помощью панчера с фильтр-карт. После проведения промывок кружка, полученного с фильтр карты, а затем его нагревания в растворе для элюции, происходит очистка и вымывание геномной ДНК с фильтра. На следующем этапе происходит ПЦР-амплификация полученных образцов ДНК в режиме реального времени. Процесс амплификации заключается в серии повторяющихся циклов температурной денатурации ДНК, отжига праймеров, комплементарных специфическому участку ДНК, и последующей достройке полинуклеотидных цепей с этих праймеров ферментом Taq-полимеразой. В основе получаемых результатов лежит метод относительного количественного анализа или метод ΔΔCt. Детекция сигнала осуществляется по разным каналам (FAM, ROX, HEX, Cy5) за счёт присутствия флуоресцентных меток, а также гасителей на зондах. При обработке результатов ПЦР-РВ количество копий гена интереса определяется на основе концентрации продукта ПЦР-РВ с этого гена по отношению к концентрации продукта ПЦР-РВ с референсного гена, который присутствует в геноме в 2 копиях. Контроли для анализа ПИД не предоставляются. Количественное содержание молекул TREC и KREC осуществляется по формуле, указанной в инструкции к набору реагентов.

Количество анализируемых образцов одним набором: 100 образцов в 2 повторностях.

Чувствительность и специфичность исследования: 100% чувствительность и специфичность без учёта точечных мутаций.

Возможные результаты исследования

Делеция 7 экзона гена SMN1 обнаружена в гомозиготном состоянии/в гетерозиготном состоянии/не обнаружена
Количество молекул TREC и KREC на 10⁵ лейкоцитов

Преимущества набора реагентов

Простота и быстрота метода (исследование занимает менее суток)
Специфические флуоресцентные метки снижают риск детектирования побочных продуктов амплификации, повышая точность исследования
Возможность выявления гетерозиготных носителей СМА (SMN1 del/+)
Низкая стоимость исследования в сравнении с другими методами (например, MLPA)
Одновременная детекция маркеров для нескольких заболеваний, входящих в неонатальный скрининг по международным стандартам
Совместимость с автоматическими станциями выделения ДНК и различными приборами для ПЦР-РВ

Краткое описание заболеваний

Спинальная мышечная атрофия (СМА, OMIM 253300, 253550, 253400, 271150) — аутосомно-рецессивное заболевание, вызванное прогрессирующей дегенерацией и необратимой гибелью альфа-мотонейронов в передних рогах спинного мозга, то есть нижних двигательных нейронов. Дебют заболевания колеблется от рождения до зрелого возраста.

Эпидемиология. Частота встречаемости заболевания – 1 на 6500-8000 новорождённых, частота носительства – 1 на 40-50 человек.

Этиопатогенез. Развитие всех форм СМА вызвано мутациями в генах выживания моторных нейронов SMN1 и SMN2 (расположены в области 5q13.2). В 98% случаев пациент наследует два гетерозиготных варианта от родителей-носителей, а оставшиеся 2% объясняются патогенным вариантом de novo у ребёнка. При этом около 3-4% людей имеют обе копии гена SMN1 на одной хромосоме (генотип «2+0»), а 2% являются носителями точечных мутаций, выявляемых только при секвенировании гена. Несмотря на большую фенотипическую изменчивость заболевания, 95% пациентов имеют гомозиготную делецию 7 (иногда 7 и 8) экзона гена SMN1 (OMIM 600354), около 5% людей со СМА являются компаунд-гетерозиготами – имеют одну аллель с делецией/конверсией экзона 7 и другую аллель с атипичной точечной мутацией, в основном в экзонах 6 и 7. Очень редко и только при кровнородственных браках сообщалось о двух точечных заменах в SMN1.

Люди – единственный вид, несущий два разных паралога SMN, SMN1 и SMN2, все остальные виды имеют только один вариант гена Smn. Два гена SMN отличаются всего пятью нуклеотидами. Критическое различие заключается в функционально значимой замене нуклеотида C на T в экзоне 7. Область, кодируемая экзоном 7, имеет решающее значение для олигомеризации и функционирования белка. Экзон 7 правильно сплайсирован в SMN1 и кодирует функциональный полноразмерный белок SMN, тогда как SMN2 продуцирует в основном транскрипты, в которых отсутствует экзон 7 (белок получается нестабильным, неспособным к олигомеризации и, таким образом, склонным к деградации), и лишь небольшую часть (около 10-15%) правильно сплайсированных транскриптов.

Тяжесть заболевания определяется главным образом количеством копий гена SMN2 (OMIM 601627): оно может варьировать от 0 до 8, и чем больше копий SMN2 имеется у пациента со СМА, тем мягче фенотип. Частой причиной вариаций числа копий гена SMN2 является неравная рекомбинация и конверсия гена SMN1 в SMN2, поскольку регион довольно нестабилен. Четыре и более копии SMN2 обычно генерируют количество функционального белка SMN, достаточное для обеспечения более лёгкого фенотипа заболевания.

Клиническая картина. Характерными симптомами являются гипотония, мышечная атрофия и симметричная слабость проксимальных мышц с преимущественным поражением нижних конечностей. Признаки поражения верхних двигательных нейронов или симптомы со стороны ЦНС (такие как судороги или нарушение зрения или слуха) не наблюдаются у пациентов со СМА. До того, как были разработаны методы лечения, СМА была разделена на три основных типа (типы I–III) в зависимости от возраста начала заболевания и достигнутых моторных навыков. Появление дополнительных фенотипов расширило эту классификацию, включив в неё врождённую СМА (тип 0 или Ia) и СМА с взрослым началом (тип IV). Позднее было рекомендовано переклассифицировать пациентов на лежачих, сидячих и ходячих. Этот подход фокусируется на текущем функциональном состоянии пациента и ответе на терапию. При всех типах СМА, в частности, когнитивные функции не затрагиваются, пациенты имеют интеллект от среднего до выше среднего.

Диагностика. Если врач клинически подозревает СМА после тщательного сбора анамнеза и клинического обследования, назначается подтверждающая генетическая диагностика. Делецию экзона 7 SMN1 и количество копий гена SMN2 можно определить с помощью нескольких методов, включая количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ПЦР-РВ) и мультиплексную лигазную реакцию с последующей амплификацией зондов (MLPA). Эти тесты имеют 95% чувствительность и почти 100% специфичность. Для выявления точечных замен используется секвенирование всех экзонов гена, включая преэкзонные области, а генотип «2+0» можно обнаружить благодаря цифровой ПЦР.

Лечение. Этиопатогенетическая терапия включает интратекальный препарат нусинерсен (Спинраза®, антисмысловой олигонуклеотид) и пероральный препарат рисдиплам (Эврисди®, модификатор сплайсинга РНК) для лечения всех типов СМА и внутривенный препарат онасемноген абепарвовек (Золгенсма®, заместительная генная терапия) для лечения СМА I типа. Эти методы лечения могут предотвратить развитие или замедлить прогрессирование некоторых признаков СМА. Эффективность значительно повышается, когда лечение начинается до появления симптомов.

Первичные иммунодефициты (ПИД) – группа заболеваний с разным типом наследования, возникающая в результате врождённой недостаточности или отсутствия элементов иммунной системы. В настоящий момент насчитывается более 450 нозологий. Первичный иммунодефицит подразделяется на типы, которые вызывают дефицит Т-клеток, дефицит В-клеток, дефицит как Т-клеток, так и В-клеток, дефицит комплемента, дефицит фагоцитов и дефицит иммуноглобулина А. Первичные иммунодефициты, приводящие к дефициту Т-клеток, включают синдром Ди Джорджи, также известный как врождённая аплазия тимуса, хронический кожно-слизистый кандидоз, синдром гипериммуноглобулина М и дефицит рецептора интерлейкина-12. Первичный иммунодефицит, приводящий к дефициту В-клеток, включает Х-сцепленную агаммаглобулинемию Брутона. Первичные иммунодефициты, приводящие к дефициту как Т-, так и В-клеток, включают тяжёлый комбинированный иммунодефицит, синдром Вискотта-Олдрича, иммунодефицит с атаксией-телеангиэктазией и дефицит главного комплекса гистосовместимости.

Эпидемиология. Ежегодная рождаемость детей с ПИД в РФ составляет не менее 1 на 16000-17000 новорождённых. Частота выявления ПИД в некоторые года достигала 1 на 100000-150000 детского населения. Средняя распространённость всех ПИД в РФ составляет 1,5 на 100000 населения, она значительно отличается для отдельных нозологий ПИД и различных регионов РФ.

Этиопатогенез и клиническая картина. Большинство иммунодефицитов имеют Х-сцепленный или аутосомно-рецессивный тип наследования. В-клетки превращаются в плазматические клетки, которые продуцируют большое количество антител. Т-клетки дифференцируются в хелперные, цитотоксические или супрессорные. Т-клетки стимулируют выработку антител, борются с внутриклеточными микроорганизмами, включая грибки, вирусы, а также с опухолями. Дефицит любого из этих звеньев иммунитета будет приводить к восприимчивости к инфекциям редкими и условно-патогенными микроорганизмами и их частым рецидивам, отставанию в развитии, некоторыми воспалительным или аутоиммунным нарушениям. Дефицит В-клеток предполагает рецидивирующие пневмонии, вызванные внеклеточными бактериями. С другой стороны, рецидивирующие грибковые инфекции могут быть обусловлены недостатком Т-лимфоцитов. Без своевременной ранней диагностики и лечения дети с ПИД страдают от инфекционных заболеваний с тяжёлым течением, что приводит к их инвалидизации или смерти.

Диагностика. Диагностика ПИД проводится путём определения уровня внехромосомных кольцевых молекул ДНК, являющихся универсальными маркерами Т-клеточных иммунодефицитов – TREC (Т-cell receptor excision circle, эксцизионные коьца Т-клеточного рецептора) и В-клеточных иммунодефицитов – KREC (kappa-deleting recombination excision circle, рекомбинационные кольца каппа-делеционного элемента). Количество TREC и KREC может быть оценено с помощью ПЦР-РВ и, ввиду прямого маркирования зрелых наивных Т- и В-лимфоцитов, имеет высокий диагностический потенциал. Количественный анализ TREC активно применяется для оценки функции тимуса и неогенеза Т-клеток. Он был использован для диагностики иммунодефицитов, для неонатального скрининга ПИД у новорождённых, а также как предиктор восстановления Т-клеточной функции после пересадки костного мозга. В целом, низкие уровни TREC и KREC в крови новорождённых указывают на Т- и/или В-клеточную лимфопению, что позволяет применять определение уровней TREC и KREC для ранней диагностики ПИД.

Лечение. Применяются терапия иммуноглобулинами, экстрактом диализируемых лейкоцитов, используются противогрибковые, противовирусные препараты и антибиотики, возможно лечение иммуносупрессорами и пересадка органов и тканей (костный мозг, тимус).

Синонимы названий заболеваний, для которых предназначен набор

Спинальная мышечная атрофия, спинальная амиотрофия, болезнь Верднига-Гоффмана, болезнь Дубовица, болезнь Кугельберга-Веландера, СМА 5q
Первичные иммунодефициты, врождённые иммунодефициты

Остались вопросы? Свяжитесь с нами